Результаты работ, выполненных по гранту «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» Соглашение № 075-15-2021-1395 от «25» октября 2021 г (Гентех) за 2022 год

1. Согласно ПГ проекта развивается лаборатория молекулярно-генетических

и микробиологических методов (https://knc.ru/science/lmgmm), а также организована коллекция биотехнологических микроорганизмов для хранения выделенных и изученных штаммов. Штаммы из коллекции лаборатории МГММ

2. Исследованы изменения микробиома культурных растений: пшеница, ячмень, кукуруза, подсолнечник и рапс, в зависимости от стадии развития растения. Метагеномное секвенирование использованное для анализа выявило изменения, происходящие с микробиомом развивающегося растения.

Представленность бактерий на уровне классов в образцах фоновой почвы, побегов и корней (ризосферы и ризопланы) озимой пшеницы на стадии развития «трубкование»).

3. Было выделено 6444 бактериальных изолята непосредственно из полевых угодий 6 важнейших сельскохозяйственных культур (озимая и яровая пшеница, рапс, подсолнечник, кукуруза, ячмень). В качестве первичных селективных параметров были проанализированы способность изолятов к мобилизации основных неорганических элементов (азота и фосфора), способность к разложению сложных органических соединений (целлюлозы, крахмала, липидов) и предрасположенность к антагонистической активности, а именно ряд наиболее предпочтительных в случае биоконтрольных агентов ферментативных активностей (протеиназная, фитазная, липазная, целлюлазная, хитиназная, амилазная и способность к фиксации атмосферного азота).

Графики процентного соотношения ферментативной активности изолятов, выделенных из образцов фоновых почв полей кукурузы и озимой пшеницы. Обозначения: 1) А, Б – образцы почв полей кукурузы, фазы развития 3 листов и трубкования. 2) В, Г. — образцы почв полей озимой пшеницы, фазы развития трубкования и цветения.

4. Определена возможность формирования консорциумов между отобранными исследуемыми микроорганизмами: произведена экспериментальная оценка совместимости штаммов, а также их влияние на защиту растений от фитопатогенов.

Сравнение штаммов реизолированных после совместного колонизационного эксперимента. Дорожки с 1 по 6 внесенные штаммы, Р –эталонный штамм колонизатор.

5. Проведено полногеномное секвенирование отобранных потенциальных биоконтрольных штаммов и дана полная характеристика данных штаммов на уровне генома. Были выявлены биосинтетические гены и кластеры генов, задействованные в продукции широкого ряда биоактивных вторичных метаболитов и ферментов, что подтвердило обоснованность выбора данных штаммов как потенциальных биоконтрольных агентов и их дальнейшее исследование для создания биопрепаратов

Анализ распределения генов в геноме L. fusiformis MRh44 с использованием системы RAST.

6. Показано, что за исключением протеобактерий, все выявленные виды бактерий с трудом подлежат генноинженерным манипуляциям, что осложняет планируемые работы по созданию энтомотропных живых векторов для доставки в членистоногих малых РНК.

Экспрессия флюоресцирующего белка в отобранных штаммах бактерий

7. Показана возможность использования существующих векторных систем для получения продуцентов коротких и протяженных дсРНК на базе выделенных штаммов энтомопатогенных бактерий проводили практическое тестирование генетической системы, предназначенной для создания векторов, обеспечивающих способность энтомотропных микроорганизмов синтезировать миРНК индуктора РНК-интерференции.

Рестриктная карта и расположение структурных элементов конструкции pCX-RFP, предназначенной для введения в потенциально энтомотропные штаммы Paenalcaligenes suwonensis, Alcaligenes faecalis, Paenalcaligenes sp. и Sphingobacterium psichroaquaticum

8. Показано влияния отдельных наиболее перспективных микроорганизмов и их консорциумов на экспрессию генов в растениях для отбора микроорганизмов, минимально вызывающих стресс у культурных растений.

Изменение экспрессии генов PR1, PR2, PR4, PR9 и PR10 при инокуляции проростков пшеницы бактериями P.putida PCL1760, Bacillus mojavensis PS17, P. fluorescens WCS365 и их консорциумом, а также фитопатогенным грибом Puccinia triticina в качестве положительного контроля.

9. Проведено исследование особенностей микробиома различных генотипов сельскохозяйственных культур и изменений в нем при применении микробных биопрепаратов, а также выделены новые эндофитные штаммы проявляющие антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам.

Оценка активности изолятов в отношении Alternaria alternata (выделен изолят ЯК26.3)

Разработана система мониторинга количества фитопатогенов как в растительном материале, так и в почве. Количественная оценка наличия фитопатогенного гриба в смеси ДНК фитопатогена с ДНК растений и почвы. За 100 % принято 0,05 нг чистой ДНК фитопатогена.

11. Предложены первичные способы получения экспериментальных образцов микробных культур на основе выделенных и используемых в работе микроорганизмов

Динамика рН и рО2 при оптимизированном глубинном культивировании штамма B. velezensis KS04AU.

Результаты работ, выполненных по гранту «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» Соглашение № 075-15-2021-1395 от «25» октября 2021 г (Гентех) за 2023 год

1. За отчетный период было произведено дооснащение лаборатории молекулярно-генетических и микробиологических методов необходимым оборудованием, проводилось обучение персонала, публикация работ, и разработка методов и протоколов для проведения экспериментов.

2. За отчетный период было произведено дооснащение коллекции микробиологическим оборудованием, создана база данных штаммов коллекции с возможностью доступа через интернет-ресурсы на официальном сайте ФИЦ КазНЦ РАН.

Ферментативные активности выделенных штаммов

3. В результате изучения геномов наиболее преспективных штаммов, использованных для создания консорциумов получено описание систем, важных для колонизации растений и взаимодействия с другими микроорганизмами.

Аннотированные геномы штаммов из консорциума озимой пшеницы

4. Приведены данные транскриптомного анализа влияния наиболее перспективных штаммов их консорциумов на активацию экспрессии генов врожденного иммунитета и маркеров стресса растений. Это позволило определить панель генов, которую можно использовать для оценки биозащитных штаммов и поиска среди них оптимальные инокулянты с наименьшим негативным влиянием на растения.

Пример хроматограммы транскриптомной библиотеки, приготовленной из образцов РНК, выделенных после инокуляции проростков пшеницы сорта «Универсиада» с буферным раствором (контроль), три биологические повторности.

5. Представленный анализ последовательности геномов, аннотации в полногеномных ДНК- последовательностях позволяет предложить данные энтомопатогенные бактерии в качестве векторов для создания узконаправленных биоинсектицидов на принципе РНК-интерференции.

Кольцевая хромосома штамма В. halotolerance; штамм выделен с энтомопатогенной нематоды

6. Предложены ДНК-конструкции для экспрессии индукторов РНК-интерференции, специфических против генов актуальных вредителей сельскохозяйственных растений (блошка крестоцветная, хлебные блошки, капустная моль) и рекомбинантные штаммы на их основе.

Карта вектора для клонирования интерферирующих последовательностей

7. Применение биопрепаратов на основе травяной муки и штаммов, выделенных из высушенных сеянных трав оказывало благотворный эффект на цыплят-бьройлеров. Суммируя вышесказанное, получены сведения об эффективности применения кандидатных пробиотических препаратов на основе травяной муки.
8. Применение биопрепаратов на основе травяной муки и штаммов, выделенных из высушенных сеянных трав оказывало благотворный эффект на здоровье кур-несушек. Суммируя вышесказанное, получены сведения об эффективности применения кандидатных пробиотических препаратов на основе травяной муки. Таким образом, работы, запланированные в п. ПГ3.2.6 выполнены полностью.

  Экспериментальные цыплята-бройлеры и куры-несушки для испытания кормовых добавок травяной муки и пробиотических препаратов на основе бактерий выделенных из сена сеянных трав.

9. В результате проведенных экспериментов разработана лабораторная технология получения биопрепаратов для лабораторных и мелкоделяночных экспериментов, в соответствии с работами п. 3.2.7.

10. Разработаны биопрепараты и технологии применения полученных биопрепаратов на пшенице, горохе и кукурузе, а также показана их эффективность на этих культурах, в соответствии с работами, запланированными в п. 3.2.8 ПГ.

Растения, обработанные штаммами эндофитных бактерий (выращены в песке)

11. Создана лабораторная технология выделения совместимых штаммов из естественных микробных консорциумов растения, комбинирующая генетические и микробиологические подходы, в соответствии с работами, запланированными в п. 3.2.9 ПГ.

Система отбора штаммов из проб растений для выделения агентов биологической защиты и фитостимуляторов.

12. Получены модельные системы ячмень-Fusarium culmorum и лук посевной- штаммы Fusarium для оценки защитного эффекта агента биозащиты растений.

Влияние биоконтрольных бактерий на количество ДНК F. culmorum 30 в корнях ячменя. Выделенные Штаммы фитопатогенных грибов, выделенные из зараженных лукович.

13. Получено четыре комбинации штаммов, совместимых между собой, что позволило составить четыре консорциума из штаммов, проявляющих в совокупности биозащитные и фитостимулирующие свойства. Данные консорциумы проявляли стабильность при поддержании in planta. Получены эффективные сочетания микроорганизмов, таким образом работы.

Совместимость бактериальных штаммов консорциума №4 на питательных средах LB, KB, PDA. Электрофореграмма ПЦР-фингерпринтинга изолятов, выделенных из смыва корня опытных растений. К1 – АНМ109, К2 – АНМ79, К3 – АНМ107, К4 – КМ24, 1-36 – выделенные штаммы.

14. Подобраны эффективные дозировки, а также показано положительное влияние консорциумов микроорганизмов на яровую и озимую пшеницу.

Опрыскивание опытных делянок яровой пшеницы