В рамках выполнения проекта «Разработка рекомбинантного штамма на основе Рseudomonas putida PCL1760 для биокаталитической трансформации ароматических производных лигнина» сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических и микробиологических методов были получены мутантные формы О-деметилазы AgcA, из которых наиболее перспективными по спектру утилизируемых субстратов оказались AgcAF166I, АgcAV294A и двойной мутант АgcAF166I V294A и, которые по результатам тестирования in vivo и in vitro, проявляли активность и аклкил-гваяколам 4-метил гваяколу и 4-пропил-гваяколу.
Скрининг полученных мутантов AgcA на чашках, содержащих различные субстраты.
1. Клетки, содержащие вектор pJNTNL без вставки, 2. pJNTN—L—AgcAwt,
3. pJNTN—L—AgcA(F166I), 4. pJNTN—L—AgcA(S165G/F166I/T167A),
5. pJNTN—L—AgcA(F166G), 6. pJNTN—L—AgcA(S165G/F166G/T167A),
7. pJNTN—L—AgcA(V294A)
Интеграция мутантных генов AgcA с редуктазой AgcВ в геном штамма P. putida LN6161, несущего оперон деградации катехола, позволила получить штаммы, которые могли расти на 4-метил гваяколе и 4-пропил-гваяколе. Сравнение ростовых характеристик полученных штаммов LN6161 RS01150::Ртас-agcAV294A-B, LN6161 RS01150::Ртас-agcAF166I-B и LN6161 RS01150::Ртас-agcAF166I V294A-B показало, что штамм с двойным мутантом гена agcAF166I V294A, показывает наилучший рост на обоих субстратах, намного превосходя штаммы с исходным вариантом agcA.