Лаборатория создана в ноябре 2021 г. при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках проекта «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве»
Лаборатория ориентирована на решение проблем эффективности биопрепаратов при их использовании в открытом грунте, а также внедрении молекулярно-генетических методов для анализа консорциумов микроорганизмов, характеристики наиболее перспективных штаммов и разработки систем мониторинга фитопатогенов в решении проблем защиты растений.
Биологическая защита растений
Заболевания растений являются одним из факторов, серьезно ограничивающих продуктивность сельского хозяйства во всем мире. Ежегодный ущерб, причиняемый фитопатогенными микроорганизмами, значительная часть которых представлена паразитическими грибами, составляет, по разным оценкам, от 15 до 20% общей продуктивности мирового растениеводства. Ранняя диагностика заболеваний растений, например, методами на основе полимеразной цепной реакции, позволяет обнаружить следовые количества патогенных микроорганизмов в максимально сжатые сроки, выбрать и своевременно применить меры защиты, что снижает экономические риски сельского хозяйства, связанные с заболеваниями растений. В настоящее время химические пестициды являются наиболее востребованным инструментом в защите растений. Токсичность этих агрохимикатов для окружающей среды, персонала сельскохозяйственных (с/х) предприятий и конечного потребителя с/х продукции общеизвестна и вызывает серьезную озабоченность в обществе. Введенные Европейским Союзом ограничения на использование химических пестицидов в тепличных хозяйствах стимулировали поиск альтернативных методов борьбы с заболеваниями растений. Одним из таких методов является применение биологических препаратов, которые в отличие от химических пестицидов безвредны для окружающей среды и потребителя. Не смотря на значительный перечень зарегистрированных биопрепаратов и их очевидные преимущества перед химикатами, они пока не находят широкого применения в с/х. Причина такого пренебрежения, коренится не только в сложных и дорогих процедурах сертификации биопестицидов, но и в нестабильности их защитного эффекта в полевых условиях. Варьирующие условия окружающей среды могут оказывать значительное влияние на защитные свойства микроорганизмов, что сказывается на эффективности биопрепаратов. Целью проекта «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» является детальное изучение микрофлоры культурных растений и создание аналогов естественных микробных консорциумов, состоящих из полезных и совместимых между собой микроорганизмов. Поддерживаясь как консорциум на растении, они могли бы значительно повысить стабильность и длительность действия защиты растений. В процессе выполнения проекта также будут созданы модельные системы для определения эффективности агентов биологической защиты растений, выделены и охарактеризованы новые штаммы-агенты биологической защиты растений, а также разработаны лабораторные образцы комплексных биопрепаратов. Научные направления лаборатории: 1) выделение и характеристика микроорганизмов из почвы и растений:- Анализ микробиома культурных растений: пшеницы, ячменя, кукурузы, рапса и подсолнечника;
- Характеристика микробиома растений методами метагеномного анализа;
- Описание микробных консорциумов. Выявление доминирующих групп ;
- Выделение и анализ свойств полезных микроорганизмов, ассоциированных с растениями;
- Выяснение таксономической принадлежности изолятов, генетический анализ выделенных штаммов;
- Выявление штаммов микроорганизмов, демонстрирующих эффект биологической защиты;
- Расшифровка и анализ геномов наиболее перспективных изолятов.
- Сравнительный анализ влияния штаммов на растения с помощью транскрипционного анализа.
- Определение поведения сочетания полезных штаммов (консорциумов) на растении.
- Анализ защитного эффекта консорциумов
- Поиск принципов совмещения штаммов на основе анализа геномов микроорганизмов, сопоставления с данными фенотипической характеристики (физиологии и биохимии штаммов)
- Разработка систем диагностики болезней растений на основе мониторинга фитопатогенов
- Определение реакции растений (транскриптом) на атаку фитопатогенов;
- Выявление и молекулярно-биологическая характеристика патогенных свойств микроорганизмов.
КАДРЫ:
В штат лаборатории входит 26 сотрудников, в том числе 18 молодых ученых, в том числе 4 аспиранта и 3 студента.
РУКОВОДИТЕЛЬ лаборатории:
Валидов Шамиль Завдатович, PhD, (hi 12)
Участвовал в работах по выделению и характеристике полезных штаммов микроорганизмов, ассоциированных с растениями для использования в качестве агентов биологической защиты растений. Имеет многолетний опыт работы в научных учреждениях в России и за рубежом (Нидерланды, США, Германия, Франция). Более 40 публикаций в журналах индексируемых Scopus и WoS и семи патентов.Сотрудники лаборатории
| Александрова Н.М. | к.б.н., старший научный сотрудник |
| Афордоаньи Д.М. | к.б.н., старший научный сотрудник |
| Валеева Л.Р. | к.б.н., старший научный сотрудник |
| Валиахметов Э.Э. | инженер-исследователь |
| Варфоламеев А.А. | младший научный сотрудник |
| Вдовина Н.Г. | инженер |
| Газизов И. | младший научный сотрудник |
| Гимадиев Т.Р. | PhD, старший научный сотрудник |
| Губанова Е.М. | инженер-исследователь |
| Диабанкана Р.Ж. | младший научный сотрудник |
| Зиннатова Ф.Ф. | к.б.н., старший научный сотрудник |
| Красновид Ф.Э. | младший научный сотрудник |
| Кучаев Е.С. | младший научный сотрудник |
| Мифтахов Е.С. | младший научный сотрудник |
| Низамов Р.М. | д.с-х.н, старший научный сотрудник |
| Спирина Е.В. | научный сотрудник |
| Трахтманн Н.В. | к.б.н., старший научный сотрудник |
| Усачев К.С., | д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник |
| Файзуллин Р.Р. | инженер |
| Фролов М. | лаборант |
| Чернова О.А., | д.б.н., главный научный сотрудник |
| Шульга Е.Ю. | инженер-исследователь |
| Юсупов М.М. | д.х.н., ведущий научный сотрудник |
| Янковский Н.К. | академик РАН, главный научный сотрудник |
Работа в лаборатории (2021 г.)
Сбор образцов озимой пшеницы для определения состава микробиома растений и выделения микроорганизмов.
Работа в лаборатории молекулярно-генетических и микробиологических методов по выделению и характеристике микроорганизмов
Выделенные микроорганизмы и их физиолого-биохимическая характеристика (фитазная, протеазная и целлюлазная активности). Типизация микроорганизмов на основе молекулярно-генетических методов (фингерпринтинг)
Проведение открытого урока в школе №111 (г Казань) с привлечением школьников 9х классов для обработки образцов растений озимого рапса в рамках мероприятий гражданской науки.
Результаты работ, выполненных по гранту «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» Соглашение № 075-15-2021-1395 от «25» октября 2021 г (Гентех) за 2022 год
- Согласно ПГ проекта развивается лаборатория молекулярно-генетических
и микробиологических методов (https://knc.ru/science/lmgmm), а также организована коллекция биотехнологических микроорганизмов для хранения выделенных и изученных штаммов.
Штаммы из коллекции лаборатории МГММ
- Исследованы изменения микробиома культурных растений: пшеница, ячмень, кукуруза, подсолнечник и рапс, в зависимости от стадии развития растения. Метагеномное секвенирование использованное для анализа выявило изменения, происходящие с микробиомом развивающегося растения.
Представленность бактерий на уровне классов в образцах фоновой почвы, побегов и корней (ризосферы и ризопланы) озимой пшеницы на стадии развития «трубкование»).
- Было выделено 6444 бактериальных изолята непосредственно из полевых угодий 6 важнейших сельскохозяйственных культур (озимая и яровая пшеница, рапс, подсолнечник, кукуруза, ячмень). В качестве первичных селективных параметров были проанализированы способность изолятов к мобилизации основных неорганических элементов (азота и фосфора), способность к разложению сложных органических соединений (целлюлозы, крахмала, липидов) и предрасположенность к антагонистической активности, а именно ряд наиболее предпочтительных в случае биоконтрольных агентов ферментативных активностей (протеиназная, фитазная, липазная, целлюлазная, хитиназная, амилазная и способность к фиксации атмосферного азота).
Графики процентного соотношения ферментативной активности изолятов, выделенных из образцов фоновых почв полей кукурузы и озимой пшеницы. Обозначения: 1) А, Б – образцы почв полей кукурузы, фазы развития 3 листов и трубкования. 2) В, Г. — образцы почв полей озимой пшеницы, фазы развития трубкования и цветения.
- Определена возможность формирования консорциумов между отобранными исследуемыми микроорганизмами: произведена экспериментальная оценка совместимости штаммов, а также их влияние на защиту растений от фитопатогенов.
Сравнение штаммов реизолированных после совместного колонизационного эксперимента. Дорожки с 1 по 6 внесенные штаммы, Р –эталонный штамм колонизатор.
- Проведено полногеномное секвенирование отобранных потенциальных биоконтрольных штаммов и дана полная характеристика данных штаммов на уровне генома. Были выявлены биосинтетические гены и кластеры генов, задействованные в продукции широкого ряда биоактивных вторичных метаболитов и ферментов, что подтвердило обоснованность выбора данных штаммов как потенциальных биоконтрольных агентов и их дальнейшее исследование для создания биопрепаратов
Анализ распределения генов в геноме L. fusiformis MRh44 с использованием системы RAST.
- Показано, что за исключением протеобактерий, все выявленные виды бактерий с трудом подлежат генноинженерным манипуляциям, что осложняет планируемые работы по созданию энтомотропных живых векторов для доставки в членистоногих малых РНК.
Экспрессия флюоресцирующего белка в отобранных штаммах бактерий
- Показана возможность использования существующих векторных систем для получения продуцентов коротких и протяженных дсРНК на базе выделенных штаммов энтомопатогенных бактерий проводили практическое тестирование генетической системы, предназначенной для создания векторов, обеспечивающих способность энтомотропных микроорганизмов синтезировать миРНК индуктора РНК-интерференции.
Рестриктная карта и расположение структурных элементов конструкции pCX-RFP, предназначенной для введения в потенциально энтомотропные штаммы Paenalcaligenes suwonensis, Alcaligenes faecalis, Paenalcaligenes sp. и Sphingobacterium psichroaquaticum
- Показано влияния отдельных наиболее перспективных микроорганизмов и их консорциумов на экспрессию генов в растениях для отбора микроорганизмов, минимально вызывающих стресс у культурных растений.
Изменение экспрессии генов PR1, PR2, PR4, PR9 и PR10 при инокуляции проростков пшеницы бактериями P.putida PCL1760, Bacillus mojavensis PS17, P. fluorescens WCS365 и их консорциумом, а также фитопатогенным грибом Puccinia triticina в качестве положительного контроля.
- Проведено исследование особенностей микробиома различных генотипов сельскохозяйственных культур и изменений в нем при применении микробных биопрепаратов, а также выделены новые эндофитные штаммы проявляющие антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам.
Оценка активности изолятов в отношении Alternaria alternata (выделен изолят ЯК26.3)
Разработана система мониторинга количества фитопатогенов как в растительном материале, так и в почве.
Количественная оценка наличия фитопатогенного гриба в смеси ДНК фитопатогена с ДНК растений и почвы. За 100 % принято 0,05 нг чистой ДНК фитопатогена.
- Предложены первичные способы получения экспериментальных образцов микробных культур на основе выделенных и используемых в работе микроорганизмов
Динамика рН и рО2 при оптимизированном глубинном культивировании
штамма B. velezensis KS04AU.
Результаты работ, выполненных по гранту «Генетическая технология селекции микроорганизмов и конструирования консорциумов на их основе для создания биопрепаратов в растениеводстве» Соглашение № 075-15-2021-1395 от «25» октября 2021 г (Гентех) за 2023 год
- За отчетный период было произведено дооснащение лаборатории молекулярно-генетических и микробиологических методов необходимым оборудованием, проводилось обучение персонала, публикация работ, и разработка методов и протоколов для проведения экспериментов.
- За отчетный период было произведено дооснащение коллекции микробиологическим оборудованием, создана база данных штаммов коллекции с возможностью доступа через интернет-ресурсы на официальном сайте ФИЦ КазНЦ РАН.
Ферментативные активности выделенных штаммов
- В результате изучения геномов наиболее преспективных штаммов, использованных для создания консорциумов получено описание систем, важных для колонизации растений и взаимодействия с другими микроорганизмами.
Аннотированные геномы штаммов из консорциума озимой пшеницы
- Приведены данные транскриптомного анализа влияния наиболее перспективных штаммов их консорциумов на активацию экспрессии генов врожденного иммунитета и маркеров стресса растений. Это позволило определить панель генов, которую можно использовать для оценки биозащитных штаммов и поиска среди них оптимальные инокулянты с наименьшим негативным влиянием на растения.
Пример хроматограммы транскриптомной библиотеки, приготовленной из образцов РНК, выделенных после инокуляции проростков пшеницы сорта «Универсиада» с буферным раствором (контроль), три биологические повторности.
- Представленный анализ последовательности геномов, аннотации в полногеномных ДНК- последовательностях позволяет предложить данные энтомопатогенные бактерии в качестве векторов для создания узконаправленных биоинсектицидов на принципе РНК-интерференции.
Кольцевая хромосома штамма В. halotolerance; штамм выделен с энтомопатогенной нематоды
- Предложены ДНК-конструкции для экспрессии индукторов РНК-интерференции, специфических против генов актуальных вредителей сельскохозяйственных растений (блошка крестоцветная, хлебные блошки, капустная моль) и рекомбинантные штаммы на их основе.
Карта вектора для клонирования интерферирующих последовательностей
- Применение биопрепаратов на основе травяной муки и штаммов, выделенных из высушенных сеянных трав оказывало благотворный эффект на цыплят-бьройлеров. Суммируя вышесказанное, получены сведения об эффективности применения кандидатных пробиотических препаратов на основе травяной муки.
- Применение биопрепаратов на основе травяной муки и штаммов, выделенных из высушенных сеянных трав оказывало благотворный эффект на здоровье кур-несушек. Суммируя вышесказанное, получены сведения об эффективности применения кандидатных пробиотических препаратов на основе травяной муки. Таким образом, работы, запланированные в п. ПГ3.2.6 выполнены полностью.
Экспериментальные цыплята-бройлеры и куры-несушки для испытания кормовых добавок травяной муки и пробиотических препаратов на основе бактерий выделенных из сена сеянных трав.
- В результате проведенных экспериментов разработана лабораторная технология получения биопрепаратов для лабораторных и мелкоделяночных экспериментов, в соответствии с работами п. 3.2.7.
- Разработаны биопрепараты и технологии применения полученных биопрепаратов на пшенице, горохе и кукурузе, а также показана их эффективность на этих культурах, в соответствии с работами, запланированными в п. 3.2.8 ПГ.
Растения, обработанные штаммами эндофитных бактерий (выращены в песке)
- Создана лабораторная технология выделения совместимых штаммов из естественных микробных консорциумов растения, комбинирующая генетические и микробиологические подходы, в соответствии с работами, запланированными в п. 3.2.9 ПГ.
Система отбора штаммов из проб растений для выделения агентов биологической защиты и фитостимуляторов.
- Получены модельные системы ячмень-Fusarium culmorum и лук посевной- штаммы Fusarium для оценки защитного эффекта агента биозащиты растений.
Влияние биоконтрольных бактерий на количество ДНК F. culmorum 30 в корнях ячменя.
Выделенные Штаммы фитопатогенных грибов, выделенные из зараженных лукович.
- Получено четыре комбинации штаммов, совместимых между собой, что позволило составить четыре консорциума из штаммов, проявляющих в совокупности биозащитные и фитостимулирующие свойства. Данные консорциумы проявляли стабильность при поддержании in planta. Получены эффективные сочетания микроорганизмов, таким образом работы.
Совместимость бактериальных штаммов консорциума №4 на питательных средах LB, KB, PDA.
Электрофореграмма ПЦР-фингерпринтинга изолятов, выделенных из смыва корня опытных растений. К1 – АНМ109, К2 – АНМ79, К3 – АНМ107, К4 – КМ24, 1-36 – выделенные штаммы.
- Подобраны эффективные дозировки, а также показано положительное влияние консорциумов микроорганизмов на яровую и озимую пшеницу.
Опрыскивание опытных делянок яровой пшеницы